北陸先端科学技術大学院大学
マテリアルサイエンス

　生命機能工学領域のGuo, Jingyuさん（博士後期課程３年）、下川 直史講師、高木 昌宏教授らの論文が米国化学会（ACS）刊行のLangmuir誌の表紙に採択されました。

■掲載誌
Langmuir 2021, 37, 32, 9683-9693
掲載日2021年7月21日

■著者
Jingyu Guo, Hiroaki Ito, Yuji Higuchi, Klemen Bohinc, Naofumi Shimokawa^*, Masahiro Takagi

■論文タイトル
Three-Phase Coexistence in Binary Charged Lipid Membranes in a Hypotonic Solution

■論文概要
　電気的に中性なリン脂質DPPCと負電荷を有したリン脂質DOPSから成る脂質二重膜での相分離現象を低張液中で観察しました。脂質膜が二成分から構成されているにも関わらず、三相に分離する条件があることを見出しました。通常、相分離は脂質疎水基間の相互作用で起こると考えられてきましたが、この三相分離構造はDOPSの電離状態に依存して形成されていることを示しました。また、三相分離構造の安定性を粗視化分子動力学シミュレーションによっても明らかにしました。

論文詳細：https://doi.org/10.1021/acs.langmuir.1c00967
表紙詳細：https://pubs.acs.org/toc/langd5/37/32

令和3年8月30日

　8月23日（月）～9月17日（金）の期間、国内最大規模の産学マッチングイベントである「イノベーション・ジャパン2021～大学見本市Online」がオンライン開催されます。
　本学からは大学等シーズ展示に以下の出展をします。

石川県公立大学法人 石川県立大学 国立大学法人 北陸先端科学技術大学院大学

新型コロナウイルスの重症化に関与するタンパク質ORF8の特異な性質を発見

【概要】

　石川県立大学 森正之准教授が中心となり、今村智弘講師、東村泰希准教授、松本健司教授および北陸先端科学技術大学院大学 生命機能工学領域の大木進野教授と共同で、新型コロナウイルス(SARS-CoV-2)の重症化関与タンパク質ORF8の特異な性質を発見しました。本研究成果は、速報誌「Biochemical and Biophysical Research Communications」に公開されました。

　SARS-CoV-2が引き起こす新型コロナウイルス感染症（COVID-19）は、基礎疾患や肥満の罹患者が重篤化しやすく、全世界で大問題となっています。新型コロナウイルスが持つORF8タンパク質は、SARS-CoV-2において特徴的なタンパク質です。これまでの解析により、ORF8は、免疫機能に重要な役割を持つMHCクラスIタンパク質の働きを抑え、細胞障害性T細胞を介した免疫応答を損なう働きがあることが報告されております。さらに、ORF8遺伝子領域が欠失したSARS-CoV-2株や1つのアミノ酸残基が変異したORF8（L84S）を持つウイルス株では、重症化しにくいことが報告されています。このことから、ORF8タンパク質は、COVID-19の重症化に関与することが示唆されています。

　ORF8タンパク質は分子内に3か所のジスルフィド結合（S-S結合）を持ち、さらにS-S結合で二量体になる複雑なタンパク質です。そのため大腸菌での均一なORF8の合成は極めて困難です。しかし、我々は、タバコ培養細胞（タバコBY-2細胞）を用いて均一なORF8タンパク質の大量合成に成功しました（図１）。

　タンパク質は一般的に、熱や酸、アルカリの影響を受けると、ひもが絡まったような変性という状態になって沈殿します。通常は、生卵が加熱されるとタンパク質が変性しゆで卵になるように、いったん変性したタンパク質は元の状態に戻りません。ORF8タンパク質がどのような条件で変性するかはその機能を知るうえで重要です。そこで、本研究では、タバコBY-2細胞で合成した野性型ORF8と変異型ORF8（L84S）の温度およびpHを変化させORF8の状態変化を核磁気共鳴（NMR）装置で解析しました。その結果、ORF8は耐熱性がとても高く70度付近まで天然状態を保持し、70度以上で変性しました。しかし、一般的なタンパク質と異なり、温度を下げると天然状態に戻ることがわかりました（図２）。またORF8は、弱酸性条件で変性してしまうこと、中性条件に戻すと元の天然状態に戻ることがわかりました。これらの結果は、ORF8が特別安定なタンパク質であることを意味します。また、興味深いことに、変異型ORF8（L84S）はORF8に比べて熱および酸への耐性がより高いことがわかりました（図２）。これらの特異な性質は、OFR8の機能と関係していることが予想されます。今後、この知見をもとにした解析を行うことにより、COVID-19の重症化をおさえる治療法が確立する可能性が期待されます。

【発表論文】

図1　タバコ培養細胞を用いたORF8タンパク質の大量生産
タバコBY-2細胞で生産したORF8タンパク質は全て二量体を形成する。(A) ORF8タンパク質を合成するタバコBY-2細胞 (B)タバコBY-2細胞の大量培養 (C)培養液中に放出されたORF8タンパク質 (D)精製しNMR解析に用いたORF8タンパク質。WT：野生型ORF8タンパク質、L84S: 変異型ORF8タンパク質、矢じり：ORF8タンパク質、M：分子量マーカー

図2　ORF8 (wild type)とその変異体L84Sの各温度での1H-NMRスペクトルのメチル基領域の拡大図　＊印は、昇温後に再びその温度に戻したことを表す。
ORF8、L84Sともに70度くらいまではスペクトルに大きな変化が見られない。これは、立体構造が保持されていることを示している。ORF8では70度、L84Sでは75度のときにピークが広幅化し、特に0 ppm付近ではピークが消失しかかっている。これは、試料が多量体化もしくは会合により熱変性状態になったことを示している。ところが、両試料ともに温度を下げたときのスペクトルは実験開始時のスペクトルと一致している。これは、変性状態の試料が天然状態に戻ったことを示している。

【用語説明】
細胞傷害性T細胞：リンパ球T細胞の一種。異物となる異常細胞（ウイルス感染細胞、がん細胞など）を認識し、それらを攻撃して破壊する細胞。
MHCクラスIタンパク質：免疫応答に関わるタンパク質。細胞内のタンパク質に由来するペプチド断片を細胞表面に輸送し、細胞障害性T細胞に提示するタンパク質。
ジスルフィド結合（S-S結合）：2つのシステインによって形成される共有結合で、タンパク質の立体構造形成に重要な役割をはたす。
二量体：２個のタンパク質が、物理的・化学的な力によって形成した分子。
核磁気共鳴（NMR）装置：強力な磁場中に置いた試料に電磁波を照射して応答信号を得る装置。信号を解析することで、試料の構造や運動性を知ることができる。

令和3年6月9日

国立大学法人 北陸先端科学技術大学院大学 国立大学法人東海国立大学機構　岐阜大学 国立大学法人 大阪大学

生体分子モーターで動く人工筋肉、光で自在に作製可能
― マイクロ・ソフトロボットの３Ｄプリントの実現に期待 ―

ポイント

• 光照射した場所に自在な形状に作製できる人工筋肉の開発に成功
• 遺伝子工学的に改変した生体分子モーターからなる光応答性の分子システムを開発
• ミリメートルスケールの微小機械の駆動を実証
• マイクロロボットやソフトロボットの３Ｄプリントの実現に期待

【研究背景と内容】

　生物のエンジン「筋肉」は、モータータンパク質^[*1]と呼ばれる生体分子モーターから構築されており、数百マイクロメートル（マイクロは100万分の1）から数十メートルまでスケーラビリティにとんだアクチュエータである。生物のエネルギー源（アデノシン三リン酸 (ATP)）を用いて高い効率で力学的仕事を行うという、従来のアクチュエータと比べ質的に異なる特性を持ち、これまでには無い産業分野での応用が期待されている。しかし、筋肉自体または筋肉細胞をアクチュエータとして利用する試みは基礎研究レベルでは報告されているが、筋肉細胞の安定性・保存性の問題やアクチュエータとして組み込む技術が未発達のため、実用化には至っていない。また、筋肉組織の構成分子はほぼ同定されているが、それら構成分子から筋肉を再構築する技術は知られていなかった。

　本研究では、生体内の収縮性ファイバーの形成過程に着想を得て、人工筋肉を自在に形成させる分子システムを開発した。モータータンパク質の一種であるキネシンを遺伝子工学的に改変し、フィラメント状にすることにより、レールタンパク質である微小管^[*2]と混ぜるだけで、モータータンパク質の動的な機能により自己組織的に人工筋肉を形成させることができた。さらに、光照射によりモーター分子のフィラメント化を開始させ、照射した部位のみに人工筋肉を形成させることを可能とした（図１）。この人工筋肉を大きさ数ミリメートルの機械構造内に形成させることにより微小機械を駆動させることに成功した（図２）。

　筋肉のような柔軟で低エネルギー・低環境負荷なアクチュエータの産業応用は期待されているが、上述のように実用化には至っていない。本研究では、生体の運動素子であるモータータンパク質分子を数ミリメートル以上の組織に構築することにより、生物の筋肉に似た機能・性質を持つ人工筋肉の製造を可能とした。特に光照射により人工筋肉の形成を開始可能なことから、たとえば光造形型の３Ｄプリンタに組み込めば人工筋肉の光造形などが可能になることが将来期待でき、生体材料で駆動するマイクロロボットやソフトロボットの３Ｄプリント技術の基盤技術となる可能性が高い。

【今後の展開】

　本研究で開発された人工筋肉は、現時点では形成・収縮が同時に起こり、かつ収縮は一回のみで用途も限定される。今後、制御用の分子システムを開発することにより、可逆または振動可能な人工筋肉を開発しマイクロロボットやソフトロボットへの実装を目指す。

図１．光照射による人工筋肉形成のコンセプト図
　モータータンパク質の一種キネシンを遺伝子工学的に改変し、光照射によりキネシンがフィラメント状になるように設計（K456m13とCaMLMM）。キネシンフィラメントは自身の運動能により微小管を引っ張り、自己組織的に筋肉に似た収縮性の繊維を形成する。

図2. 人工筋肉の応用例
　大きさ数ミリメートルのシリコンゴム製の微小構造の周囲に、光照射により人工筋肉を形成させ、その構造を駆動させた。右上）マイクログリッパ：光照射後に人工筋肉（オレンジ色）が形成し、20秒後にグリッパが閉じる。右下）昆虫型デバイス：人工筋肉により左右に動く。左上）ロボットアーム型デバイス。左中）微小歯車の組み立て。左下）細胞サイズの微小ビーズの集積。

【研究資金】

　・新エネルギー・産業技術総合開発機構（NEDO）「次世代人工知能・ロボット中核技術開発」（JPNP15009）
　・日本学術振興会（JSPS）科研費 新学術領域研究「分子ロボティクス」(JP24104004）
　・日本学術振興会（JSPS）科研費 基盤研究（B）(JP18H01407)

【論文情報】

【用語解説】
[*1] モータータンパク質（motor protein）
　生体の動きに関与するタンパク質の総称。大きさ数ナノメートル〜数十ナノメートルの分子で、代表的なものとして筋収縮に働くミオシン、細胞内の物質輸送に働くキネシン、鞭毛運動等に働くダイニンなどが挙げられる。これらは繊維状のタンパク質であるアクチンまたは微小管の上を生体のエネルギーであるATP(アデノシン三リン酸)の加水分解エネルギーを利用して一方向に動く。

[*2] 微小管（microtubule）
　細胞骨格を構成する繊維状タンパク質のひとつ。大きさ数ナノメートルのチューブリンが筒状に重合することにより直径25ナノメートルの管状の繊維を形成する。キネシンやダイニンなどモータータンパク質が動くレールとして働く。

令和3年4月20日

　本学ナノマテリアルテクノロジーセンター主催で「質量分析とNMRを組み合わせた構造解析の実際」と題して公開講座を開催いたします。
　ただいま受講者を募集しております。皆様のご参加をお待ちしております。

ポスターはこちらからご覧ください。ダウンロードできます。

新型コロナウイルスのアクセサリータンパク質ORF8大量合成に成功

　石川県立大学　森 正之准教授、今村 智弘特任講師、東村 泰希准教授が中心となり北陸先端科学技術大学院大学 生命機能工学領域の大木 進野教授と共同で、新型コロナウイルス(SARS-CoV-2)のアクセサリータンパク質ORF8について、独自に開発したタンパク質大量合成システムを用いて均一に大量合成することに成功しました。本研究成果は、「Plant Cell Reports」に公開されました。

　SARS-CoV-2が引き起こす新型コロナウイルス感染症（COVID-19）は、現在世界で猛威を振るっております。COVID-19の克服には、SARS-CoV-2のもつタンパク質の機能解明が必須であります。SARS-CoV-2のゲノム配列の解読により、SARS-CoV-2は、少なくとも１６種類の非構造タンパク質、４種類の構造タンパク質、少なくとも６または７種類のアクセサリータンパク質を感染細胞で合成することが明らかとなっております。この中で、アクセサリータンパク質の１つであるORF8タンパク質は、近縁ウイルスのORF8タンパク質と比べ相同性が低く、SARS-CoV-2において特徴的なタンパク質であります。ORF8は、免疫や炎症に関わるタンパク質に結合する可能性が報告されております。さらに、ORF8遺伝子領域が欠失したSARS-CoV-2株は、重症化しにくいことが報告されております。このことから、ORF8タンパク質は、COVID-19の重症化に関与していることが示唆されてきております。しかし、OFR8タンパク質の機能は解明されておりません。

　ORF8タンパク質の機能解明には、均一なORF8タンパク質を大量に合成することが必要です。しかし、ORF8タンパク質は分子内に3か所のジスルフィド 結合（S-S結合）を持ち、さらにS-S結合で2量体になる複雑なタンパク質です。そのため大腸菌での均一なORF8の合成は極めて困難であります。そこで、我々は、これまでにタバコ培養細胞（タバコBY-2細胞）を宿主として独自に構築した大量タンパク質合成システムを用いてORF8タンパク質の大量合成を試みました。この合成システムの特徴は、薬剤（エストラジオール）の添加によって、S-S 結合をもつ複雑な目的タンパク質を同調的に大量合成することができます（図１）。この生産システムを用いてORF8タンパク質の合成を試みたところ、培養液1 LあたりORF8タンパク質を約10 mg合成することに成功しました（図２）。合成したORF8タンパク質を核磁気共鳴（NMR）装置により解析を行ったところ、均一な構造を持つORF8タンパク質が生産されていることが明らかとなりました（図３）。

　本研究成果によって、タバコBY-2細胞を用いて、均一なORF8タンパク質の大量合成に成功しました。今後、本システムで合成したORF8を用いて、ORF8の機能が明らかになることが期待されます。さらに、ORF8をターゲットにした治療薬の開発が期待できます。

【論文情報】

図１：植物ウイルスを利用した薬剤誘導型ORF8タンパク質合成システムの概略図
①薬剤活性型転写因子（XVE）の発現。②薬剤（エストラジオール）添加によるXVEの活性化。③XVEによるトバモウイルス-ORF8融合遺伝子の発現。④リボザイムによるmRNA3'末端の切断。⑤サブゲノムRNAのmRNAの増幅。⑥ORF8タンパク質の翻訳。⑦ORF8タンパク質の細胞外への移行。ORF8タンパク質は、二量体を形成する。

図２：タバコ培養細胞を用いたORF8タンパク質の合成
(A) ORF8タンパク質を合成するタバコBY-2細胞 (B)薬剤誘導処理を行ったタバコBY-2細胞 (C) 培養液中に放出されたORF8タンパク質。矢じり：ORF8タンパク質、M：分子量マーカー

図３：ORF8タンパク質のNMRスペクトル
(A) ORF8タンパク質の¹H NMRスペクトル (B) ¹⁵NラベルをしたORF8タンパク質の二次元NMRスペクトル（¹H-¹⁵N HSQC）

令和3年1月7日

　学生の石野 佳奈子さん（博士前期課程2年、生命機能工学領域、藤本研究室）と、篠崎 一世さん（博士前期課程1年、生命機能工学領域、藤本研究室）が2020年度日本化学会北陸地区講演会と研究発表会において優秀ポスター賞を受賞しました。

　日本化学会北陸地区講演会と研究発表会は、毎年秋に、金沢大学、福井大学、富山大学、本学のいずれかの大学にて開催しています。特別講演のほか、ポスター発表があり、200～300名が参加しています。
　今回、2020年度日本化学会北陸地区講演会と研究発表会は、11月20日にオンラインで開催されました。

■受賞年月日
　令和2年11月26日

■発表題目・発表者・研究概要

1. 【石野 佳奈子さん】
   発表題目：
   光クロスリンクオリゴDNAによるピンポイント核酸塩基編集
   
   発表者名：
   石野佳奈子、中野雅元、中村重孝、藤本健造 　　　
   
   研究概要：
   本研究では、DNA鎖中でのシトシンをピンポイントでウラシルに変換する際の周辺塩基の影響を評価した。従来、光化学的にシトシンをウラシルへの変換する際には90°Cの加熱を必要としており、遺伝子疾患の治療法としての細胞内応用は困難であった。本研究ではリン酸の付与により、細胞内にも適応可能な条件での脱アミノ化に成功し、リン酸基の導入位置による違いを詳細に評価した。以上の成果は今後のウラシルからシトシンへの変異に基づく遺伝子疾患の治療法として期待される。
   
   
2. 【篠崎 一世さん】
   発表題目：
   DNA鎖中のメチルシトシン定量解析に向けた核酸類光架橋反応の開発　　　
   
   発表者名：
   篠崎一世、中島涼、中村重孝、藤本健造　　　 　　　
   
   研究概要：
   本研究では、DNA鎖中でのシトシンとメチルシトシンを定量解析に向けた光架橋反応開発を行った。メチルシトシンはエピジェネティクな遺伝子発現制御に関わる重要な核酸であるが、ピンポイントでシトシンとメチルシトシンを定量的に解析することは困難であった。そこで、シトシン、メチルシトシンそれぞれに異なる反応性を示す光架橋型人工核酸を設計・合成し、反応性を評価した。また、反応性の違いを利用したチップ上でのメチルシトシンの定量検出も可能であることを見出した。今後、生体試料中でのメチルシトシン定量解析への応用が期待される。

■受賞にあたって一言
（石野さん、篠崎さん）
　この度は、2020年度日本化学会北陸地区講演会と研究発表会におきまして、このような賞を頂けたことを大変光栄に思います。本研究の遂行にあたり、日頃よりご指導いただいている藤本健造教授にこの場をお借りして心より御礼申し上げます。さらに、多くのご助言やディスカッションに乗って頂いた藤本研究室の皆様に深く感謝いたします。

石野さん

篠崎さん

令和2年12月11日

生体内の高分子混雑に着目した新規の細胞モデルの創成に成功

　名古屋大学大学院理学研究科の瀧口 金吾講師、同志社大学生命医科学部の作田 浩輝特任助教、藤田 ふみか大学院生、北陸先端科学技術大学院大学先端科学技術研究科 生命機能工学領域の濵田 勉准教授、法政大学生命科学部の林 真人教務助手、三重大学大学院工学研究科の湊元 幹太教授、京都大学高等研究院医学物理・医工計測グローバル拠点の吉川 研一特任教授らの共同研究グループは、二種類の水溶性高分子のミクロ相分離条件下でDNAとリン脂質を共存させると、内部にDNAを取込み、リン脂質の膜で囲まれた細胞内小器官様の構造が自発的に生成することを発見しました。この発見が元になり、細胞が自律的に複雑な構造や高度な機能を生み出す機構の謎に迫る研究に発展することが期待されます。
　その成果をまとめた論文が、国際科学雑誌ChemBioChem誌のオンライン版に2020年7月15日付けで公開されましたが、この度、Very Important Paper の1つに選ばれ、研究内容を紹介するイラストがChemBioChem誌の2020年21巻23号に掲載されました。
　この研究は、平成24年度から始まった文部科学省科学研究費助成事業新学術領域『分子ロボティクス』プロジェクトおよび平成31年度から始まった日本学術振興会科学研究費助成事業『細胞結合ネットワークの構築による人工細胞モデルの組織化と集団動態発現』等の支援のもとでおこなわれたものです。

【ポイント】

• 異なる高分子 ^注１）の混雑によって高分子同士が相分離 ^注２）を起こしてミクロ液滴を形成している溶液にリン脂質を加えると、脂質が自発的にミクロ液滴の界面に局在化することで、細胞内小器官（オルガネラ）^注３）の形成に似た区画化を起こすことを発見した。
• この新知見を利用することで、リン脂質によって小胞化されたミクロ液滴の内部に、長鎖DNAを濃縮して封入させることに成功した。
• 本研究で見出されたミクロ液滴のリン脂質によって区画化される小胞化は、原始生命体（細胞の起源）のモデル実験系と成り得ると同時に、人工脂質膜小胞を調製するための有力な新手法として期待される。
• この研究成果をまとめた論文が、国際科学雑誌ChemBioChem誌に掲載され、さらに、Very Important Paper (VIP)に選ばれた。【論文を紹介するイラスト（下図）はChemBioChem誌の2020年21巻23号に掲載】

【研究背景と内容】

　近年、細胞内の複雑な構造が生み出される起源や、脂質膜によって区画化される多様な細胞内小器官および、顆粒などの膜によって隔てられていない領域 ^注３）などが形成・維持される機構について、相分離 ^注２）の視点から研究されています。
　本研究では、液－液相分離（LLPS）^注２）を示すことができる水溶性の高分子ポリマーであるポリエチレングリコール（PEG）およびデキストラン（DEX）^注１）の混合によってミクロ液滴を生成させた溶液にリン脂質を加えると、ミクロ液滴の界面に脂質が自発的に集まって膜を形成することを見出しました（図１）。この脂質に覆われたミクロ液滴が、外液の浸透圧を高張にすると、脂質二重膜でできた膜小胞と同様に破裂や穿孔、収縮をすることから（図２）、ミクロ液滴を覆う脂質が、生体膜の基本構造である脂質二重膜と同じ性質を示すことが分かりました。

図１：ミクロ液滴の界面へのリン脂質の蓄積。
リン脂質添加後のPEG / DEX混合溶液の顕微鏡画像（ミクロ液滴の生成を示す明視野像とリン脂質の局在を示す蛍光像）。蛍光像（白の破線部分）から得られた蛍光強度の空間プロファイル。

図２：高張な水溶液（NaCl溶液）の注入による脂質膜構造の形態変化。
外液の浸透圧が変化することによって、リン脂質に覆われたミクロ液滴の内部から外液に向かって大量の水分子が移動しようとする結果、脂質膜の破裂や穿孔や収縮が起きる。左から、破裂後のリン脂質の凝集塊、穿孔を起こした脂質膜の残骸、収縮した脂質膜。

　ところで、核酸であるDNAも生体内で重要な働きをしている天然の高分子です。我々共同研究グループの先行研究から、長鎖DNAがDEXを高濃度で含むミクロ液滴に遍在することが明らかにされていました。長鎖DNAを内部に濃縮して取込んだミクロ液滴を形成している相分離溶液系にリン脂質を加えると、やはり脂質が自発的にミクロ液滴を覆うことで、内部にDNAを含む細胞内小器官様の安定化された小胞の形成が認められました（図３）。
　このミクロ液滴からリン脂質膜で安定化された細胞内小器官様の小胞が自発的・自己組織的に創成されてくる過程は、原始の生命体の細胞の内部構造の起源を考える際の貴重な知見であり、多種類の高分子の混合によって細胞内小器官（オルガネラ）や膜によって隔てられていない構造が自発的に形成されてくる可能性を示した研究成果です。

図３：リン脂質の膜で区画化・小胞化されたミクロ液滴へのDNAの自発的なカプセル化。
長鎖DNAを含むPEG / DEX混合溶液にリン脂質を添加すると、自発的にDNAを取込んだ脂質の膜に覆われたミクロ液滴が生成される。

【成果の意義】

　本研究の発見は、多種類の高分子の混合によって生体高分子（ここでは長鎖DNA）を取込んだミクロ液滴が自発的に生じ、これに生体膜の重要な構成成分であるリン脂質を加えると、更にミクロ液滴の界面にリン脂質が集積して自己組織的に細胞内小器官様の小胞構造が形成されることを示した研究成果です。
　この発見の特筆すべきこととして、本研究で用いられたどの成分、高分子のPEGとDEX、生体高分子の長鎖DNA、そしてリン脂質も、酵素と基質との間に観られる鍵と錠との関係のような相互作用を互いに示さないことが挙げられます。このことは、生命現象の説明や理解に必ず分子間の特異的な相互作用の存在を想定して来たこれまでの生命科学に一石を投じるものであり、非常に重要です。
　細胞内では、細胞分裂の際、分離・分配された染色体が脂質の膜で覆われ核膜が再生することで２つの娘細胞の核が形成されます。また、オートファジーでは、変性したり役目を終えたりした生体因子や細胞内に侵入して来た細菌などの外敵の分解除去のため、あるいは細胞内物質のリサイクルのため、それらを取り込む様に脂質膜でできた"袋"を形成します。これらのことから、本研究で得られた知見は、非膜性の顆粒の様な細胞内領域と膜に覆われた細胞内小器官との関係に新たな視点を与えると共に、濃厚環境での生体高分子の在り様、細胞内に観察されるような重層的に区画された領域や細胞内小器官の様な特別な構造の起源の理解に迫る成果だと言えます。

【用語説明】

• 注１） 高分子（ポリマー）：
  ある化学物質が、様々な結合を介して連なっていくことで、より大きな分子になったもの。一本の鎖状のポリマーもあれば、枝分かれしながら繋がっているポリマーもあります。
  今回の研究で用いられたポリエチレングリコール（PEG）やデキストラン（DEX）は、その代表的なものです。
  DNAも、ヌクレオチドが連なってできた天然のポリマーです。生体内には、様々な糖鎖やアクチン線維や微小管の様なアクチンやチューブリンと呼ばれる蛋白質が繊維状に集まってできた細胞骨格などが存在していますが、これらも天然のポリマーと考えることができます。
• 注２） 相分離、液－液相分離 (Liquid-Liquid Phase Separation, LLPS)：
  LLPSは、複数の水溶性高分子を混合し混雑化すると（図４ (a)）、ある高分子が他の高分子よりも高濃度で存在する領域が水溶液中に現れる現象です。このように異なる領域に分かれていく現象を相分離と呼びます。そのようにしてできてくる領域ですが、混合の仕方によって生きた細胞や細胞内小器官と同等のサイズを持つミクロ液滴になります。
  今回の研究では、PEGが濃く存在する溶液中に、DEXが濃く存在するミクロ液滴が生じる条件下で実験が行われました（図４ (b)）。

図４：PEGとDEXの混合（左）によって生じるLLPS（上）。Bars = 100 μm。本共同研究グループの先行研究論文 ChemBioChem 2018, 19(13), 1370-1374 (Figure S1) より転載。

• 注３） 細胞内小器官（オルガネラ）：
  細胞内に存在する核やミトコンドリア、ゴルジ体などの総称。
  これまで細胞内小器官は、膜によって外界から隔てられて、その構造や機能が維持されていると考えられてきました。しかし近年、膜によって外部から隔てられていない領域・顆粒（例として核小体やストレス顆粒など）が、非膜性の細胞内小器官として重要な働きを担っていることが分かってきて、それらの形成維持機構が、細胞内の複雑で階層的な構造の組織化に関連して議論される様になっていました。

【論文情報】

【研究費】

・科研費　基盤研究（A）（15H02121）
・科研費　基盤研究（C）（19K06540）
・科研費　基盤研究（B）（20H01877）
・特別研究員奨励費（18J12947）
・文部科学省新学術領域研究
「アメーバ型分子ロボット実現のための要素技術開発とその統合」（24104004）
・文部科学省新学術領域研究
「ゆらぎと構造の協奏：非平衡系における普遍法則の確立」（25103012）
・文部科学省新学術領域研究
「宇宙からひも解く新たな生命制御機構の統合的理解」（18H04976）

令和2年12月9日

世界初 キヌアからブラッダー細胞形成遺伝子を発見

　石川県立大学 森 正之准教授、今村 智弘特任講師、古賀 博則客員教授、高木 宏樹准教授、北陸先端科学技術大学院大学先端科学技術研究科、生命機能工学領域の大木 進野教授らは、(公財)岩手生物工学研究センターなどの機関と共同で、塩生植物キヌア（Chenopodium quinoa）からブラッター細胞の形成に関わる遺伝子を発見しました。 本研究成果は、「Communications Biology」で公開されました。

＜ポイント＞

• キヌアからブラッダー細胞形成に関わる新規WD40タンパク質をコードするREBC遺伝子を発見
• REBC遺伝子は、ブラッダー細胞形成のみならず葉緑体形成にも関与していることを発見
• ブラッダー細胞の茎頂保護機能を発見

＜発表論文＞

＜研究の背景＞

　国連大学の報告によると、世界の灌漑地の約1/5が塩害にさらされています。その被害は、年間およそ273億USドルの経済損失を引き起していることが報告されており、今後さらに広がることが予想されています。一方、世界の人口は、2050年までに97億人に達することが予想されております。そのため、この人口の爆発的な増加に耐えうる食糧生産は、早急に解決すべき大きな課題となっております。しかし、主要穀物である小麦やイネなどは、塩に弱いで植物であり、これらの主要穀物に対する塩害は、食糧生産において大きな問題となります。キヌアは、非常に高い耐乾燥性と耐塩性を併せ持ち、他の植物では生育困難な厳しい環境で生育できる塩生擬似穀物です。さらに、キヌアの種子は、必須アミノ酸・ミネラル・植物繊維を豊富に含み高い栄養価を持つことから、国際連合食糧農業機関（FAO）では、世界の食糧問題解決の切り札になり得るスーパーフードとして注目されています。
　キヌアを含めたアカザ属植物は、植物体の表面に球状の表皮細胞（ブラッダー細胞）を形成します（図１）。ブラッダー細胞は、通常細胞の1000倍以上の大きさがあり、細胞内に高濃度の塩を蓄積することが知られています。このブラッダー細胞の性質は、キヌアの高い塩耐性の一因と考えられています。独自の形態と機能を持つブラッダー細胞ですが、その形成メカニズムは全く分かっていませんでした。
　本研究では、塩生植物のキヌアに形成されるブラッダー細胞の形成機構を明らかにするために、ブラッダー細胞の形成に関わる遺伝子の単離を試みました。その結果、EMS処理の変異原処理により、ブラッダー細胞が著しく減少したrebc変異体を獲得し、次世代シークエンサーを用いた解析により、ブラッダー細胞形成に関わるrebc変異体の原因遺伝子(REBC)の単離に成功しました。その単離したREBC遺伝子は、ブラッダー細胞を形成しない植物には存在しないことが明らかとなりました。このことから、ブラッダー細胞の形成機構は、同じ植物の表皮細胞であるトライコームの形成機構とは異なることが示唆されました。さらに、rebc変異体はブラッダー細胞の形成のみならず葉緑体の形成にも影響を及ぼしていることが明らかとなりました。また、rebc変異体を用いた環境ストレス実験により、ブラッダー細胞は、塩を蓄積するだけでなく、その細胞を密集させることにより茎頂などの組織を環境ストレスから保護していることが明らかとなりました。

＜研究の内容＞
1.ブラッダー細胞が減少した変異体の作出
　ブラッター細胞の形成に関わる遺伝子を単離するために、約8000粒のキヌア種子ついて、EMSを用いた変異原処理を実施しました。その結果、大部分のブラッダー細胞が欠失した変異体を得ることができました（図２）。この変異体を reduced epidermal bladder cells (REBC)変異体と命名しました。rebc変異体の分離比を確認しましたところ、野生型とrebc変異の割合が３：１に分離しました。興味深いことに、キヌアは異質４倍体の植物にもかかわらず、rebcの形質は、一遺伝子支配の劣勢形質であることがわかりました。

2.環境ストレス試験
　キヌアは、ブラッダー細胞に塩を高濃度に蓄積することにより、高塩環境においても正常に生育できることが知られています。そこで、大部分のブラッダーが欠失したrebc変異体について、塩ストレス実験を実施しました。その結果、rebc変異体は、野生型に比べて高濃度の塩条件において生育が阻害されていることがわかりました。さらに、別の環境ストレスとして、茎頂に風を当て続けたところ、野生型では問題なく生育したのですが、rebc変異体では風によって茎頂にダメージを受けていることが明らかとなりました（図３）。これらの実験からブラッダー細胞は、塩を蓄積する機能のほかに、茎頂などの特定の組織に密集して存在することにより、風などの環境ストレスから組織を保護していることが新たに明らかとなりました。

3.rebc変異体の原因遺伝子の特定
　rebc変異体の原因遺伝子を明らかにするために、次世代シークエンサーを用いたin silico subtraction 法を利用して変異箇所の特定を試みました。その結果、rebc変異体は、新規なWD40ドメインタンパク質遺伝子の変異が原因であることを明らかにし、その遺伝子をREDUCED EPIDERMAL BLADDER CELLS (REBC)遺伝子と名付けました（図４）。他植物の表皮細胞であるトライコームでは、その形成に関与する遺伝子が同定されており、その中でWD40ドメインタンパク質としてTTG1遺伝子が重要な役割をしています。REBCとTTG1を比較したところ、これらのタンパク質は、別の機能を持つタンパク質であることが示唆されました（図５）。またトライコームを形成する植物体には、REBC遺伝子のオルソログが存在しませんでした。これらの結果より、ブラッダー細胞の形成は、トライコームとは異なる機構の存在が示唆されました。

4.rebc変異体における葉緑体形成
　rebc変異体について、網羅的な発現解析を実施したところ、発現が変動した遺伝子の多くが葉緑体局在タンパク質をコードする遺伝子でありました。さらに、クロロフィル含量を測定したところ、rebc変異体のクロロフィル含量が有意に低下していることが明らかとなりました。そこで、rebc変異体の葉緑体の形態について、電子顕微鏡を用いて観察しました。その結果、rebc変異体の葉緑体は、内部構造の約1/3が欠失していることが明らかとなりました（図６）。さらに、ブラッダー細胞の葉緑体を観察した結果、rebc変異体のブラッダー細胞の中の葉緑体は、野生型に比べクロロフィルの自家蛍光の強度が低下し、さらにブラッダー細胞あたりの葉緑体数が減少していることが明らかとなりました。以上の結果より、rebc変異体は、ブラッダー細胞の形成のみならず、葉緑体の形成にも影響を及ぼしていることが明らかになりました。

＜今後の展望＞
　本研究成果によって、キヌアのブラッダー細胞形成に関する分子メカニズムの一端を明らかにすることができました。今後、ブラッダー細胞の形成に関する分子メカニズムの全容が明らかになることが期待できます。さらに、ブラッダー細胞形成の知見を利用することによって、キヌアの塩耐性機構を組み入れた新たなコンセプトの環境ストレス耐性作物を作出することが期待できます。

図１　キヌアのブラッダー細胞　（a）キヌア植物体、（b）キヌアの葉（裏側）、（c）キヌアの葉(拡大)、
(d-f)　キヌアブラッダー細胞　BC:ブラッダー細胞、SC: 柄細胞

図２　rebc変異体について　(a-c)キヌア芽生え　（d-f）キヌア芽生え（茎頂付近）
（a, d）野生型、（b, e）rebc1変異体、（c, f）rebc2変異体

図３　風ストレス処理による影響　（a）野生型、（b）rebc1変異体、（c）rebc2変異体
・rebc変異体は風ストレスによって、茎頂が枯死している。

図４　REBC遺伝子の単離 (a) REBC遺伝子の概略図　赤矢印はrebc変異体の変異箇所
（b）rebc1×rebc2交配後代(F1)の解析
・rebc1×rebc2交配個体も、rebc変異の形質を示したことから、REBCが原因遺伝子であることが明らかとなった。

図５　(a) REBCとTTG1との比較（系統樹解析）、(b) アラビドプシスttg1変異体を用いた相補実験
上段：ベクターコントロール、中段：REBC過剰発現体、下段：AtTTG1過剰発現体
・REBCタンパク質は、TTG1タンパク質とは別のグループに属し、TTG1の機能を相補することができない。

図６　rebc変異体の葉緑体について　(a-c) 走査型電子顕微鏡像　（b-f）透過型電子顕微鏡像
（a, d）野生型、（b, e）rebc1変異体、（c, f）rebc2変異体
・rebc変異体では、葉緑体の膜構造1/3が欠失している。

＜用語説明＞

• キヌア
  　ヒユ科アカザ亜科アカザ属の植物。南米アンデス原産の穀物で必須アミノ酸・ミネラル・植物繊維を豊富に含み高い栄養価を持ち、さらに、環境適応能力が高く、非常に高い耐乾燥性と耐塩性を合わせ持ち、国際連合食糧農業機関（FAO）は、世界の食糧問題解決の切り札になり得る作物として注目している。近年、我々のグループとその他のグループによってキヌアゲノムが解読され、キヌアが持つ環境ストレス耐性および高栄養価についての遺伝子研究が進められている。
• 擬似穀物
  　米や麦などのイネ科（禾穀類）や、大豆や小豆などのマメ科（菽穀類）ではないが、見た目がイネ科の穀物に類似した食べられる種子を形成する植物（ソバ、キヌア、アマランサスなど）を指す。
• in silico subtraction法
  　次世代シークエンサーのシークエンスデータを用いて、サンプル間の塩基配列の違い（多型、変異箇所）を特定する方法。異質倍数体の植物（キヌアは異質４倍体）でも検出が可能。本研究では、親から分離した後代について、野生型形質を示す個体群と、rebc変異形質を示す個体群を、それぞれまとめてゲノムを抽出し、次世代シークエンサーによって、それぞれの形質を示す個体群のシークエンスリードを獲得。その後、二形質間のシークエンスリードを比較することにより、形質を支配する遺伝子を特定した。

令和2年9月17日

　学生の中野 雅元さん（博士前期課程2年、生命機能工学領域、藤本研究室）が2019年度日本化学会北陸地区講演会と研究発表会において優秀ポスター賞を受賞しました。
　今回、2019年度日本化学会北陸地区講演会と研究発表会は、11月29日に石川県金沢市において開催されました。

■受賞年月日
　令和元年11月29日

■発表者名
　中野雅元、Siddhant Sethi、本田望、中村重孝、藤本健造

■発表題目
　標的シトシンの周辺環境が光化学的C to U変換に及ぼす影響

■研究概要
　本研究では、DNA鎖中でのシトシンをピンポイントでウラシルに変換する際の周辺塩基の影響を評価した。従来、光化学的にシトシンをウラシルへの変換する際には90°Cの加熱を必要としており、遺伝子疾患の治療法としての細胞内応用は困難であった。そこで、変換部位周辺の塩基を変化させた際の変換効率を調べ、極性が非常に重要であることを見出した。さらに、リン酸の付与により細胞内に適応可能な条件でのシトシンからウラシルへの変換を見出した。以上の成果は今後のウラシルからシトシンへの変異に基づく遺伝子疾患の治療法として期待される。

■受賞にあたっての一言
　この度は、2019年度日本化学会北陸地区講演会と研究発表会に起きまして、このような章を頂けたことを大変光栄に思います。本研究の遂行にあたり、日頃よりご指導いただいている藤本健造教授にこの場をお借りして心より御礼申し上げます。さらに、多くのご助言やディスカッションに乗って頂いた藤本研究室の皆様に深く感謝いたします。

令和元年12月20日

　生命機能工学領域の塚原 俊文教授の人為的なRNA編集技術に関する研究がライフサイエンス専門誌日経バイオテクONLINEにおいて紹介されました。

■掲載誌
　日経バイオテクONLINE 　
　*有料会員制のサイトのため、一部情報のみ無料でご覧いただけます。

■概要 　
　遺伝子疾患の治療法としてゲノム編集技術が注目されているが、現状では全ての標的細胞で目的のDNA編集を引き起こすことはできないため、意図しない遺伝子変異を誘導する危険性がある。そのため、塚原研究室では一過的な分子であるRNAの編集技術の研究に取り組んでいる。今回は、RNAの塩基を配列特異的に脱アミノ化し、遺伝コードを修復する技術について概要を紹介した。 　

　なお、11月21日（木）には本研究に関するセミナーの開催も予定しています。詳細は、こちらをご覧ください。

令和元年10月23日

　学生のCHARERNCHAI, Sumamalさん（博士前期課程2年、高村禅研究室、生命機能工学領域）が2019年第66回春季応用物理学会講演奨励賞を受賞しました。 　

　応用物理学会講演奨励賞は、応用物理学会春秋講演会において、応用物理学の発展に貢献しうる優秀な一般講演論文を発表した若手会員に対し、その功績を称えることを目的として贈られます。

*参考：応用物理学会ホームページ

■受賞年月日
令和元年9月18日

■研究題目、論文タイトル等
Development of automated competitive ELISA paper-based analytical device using dissolvable sucrose valves for Aflatoxin B1 detection

■研究者、著者
Charernchai Sumamal, Miyuki Chikae，Wanida Wonsawat，Tue Phan Trong，Yuzuru Takamura

■受賞対象となった研究の内容
A fully automated competitive enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was established on a laser-cut paper-based device (µPAD) integrated with sucrose valve for the detection of a small-sized target, aflatoxin B1 (AFB1), which is a carcinogenic agent. Previously, our group reported automated µPAD for sandwich ELISA using inkjet printing (Apilux et al., 2013), however, which was not applicable for small-sized target and required complicated and time-consuming fabrication. Thus, faster and simpler techniques capable of high-precision mass production is a crucial need in order for µPADs to provide widespread affordable access to analytical tools. In this study, the conventional laser platform is introduced to remove the hydrophilic nitrocellulose membrane (NCM) creating a hydrophobic barrier along the edge of the cutline. Using laser cutting, an ease of use, accuracy, reproducibility and device production speed were improved (30 times faster than inkjet printing). To automate the multistep processes of competitive ELISA, sequential delivery of reagents was achieved with sucrose valve, which was designed to open spontaneously after a given delay, and was occupying smaller area with simpler structure compared to the winding path method for making delay used in previous work.

■受賞にあたっての一言
It is a great honor for me to receive the Young Scientist Presentation Award at the 80th JSAP Autumn Meeting, 2019. This is one of the most significant events of my research, academic and life's experience. It would not be possible for me to achieve this award without the constant support of many important people. Foremost, my deepest gratitude goes to Prof. Yuzuru Takamura for his great effort, generosity and guidance. Special thanks goes to Dr. Miyuki Chikae and Asst. Prof. Phan Trong Tue for their attention and advice. Last but not least, many thanks go to my family for their undying love and encouragement in me. This honorable and memorable moment will be motivation for all my future activities. Thank you so much.

令和元年9月24日

● J-BEANSセミナーの趣旨・概要等については、こちらのページをご覧ください。

　生命機能工学領域の山口拓実准教授が2019年度 (第22回) 日本糖質学会奨励賞を受賞しました。
　日本糖質学会は、1978年に設立された炭水化物研究会を前身とする学会です。生命現象のあらゆる側面において重要な役割を果たす糖鎖について、その総合科学に関する基礎・応用研究の発展向上を図り、学際的な糖鎖研究をリードしています。日本糖質学会奨励賞は、糖質科学の分野で優れた研究成果を挙げた若手研究者に対し授与されるものです。

　＊参考
　　日本糖質学会ホームページ

■受賞年月日
　令和元年8月19日

■受賞テーマ
　常磁性NMR計測を活用した糖鎖の動的立体構造解析法の開発

■研究概要
　柔軟な生命分子である糖鎖の機能を正しく理解するためには、静的な安定構造を捉えるだけではなく、動態としての描象が重要となります。本研究では、分子分光法と計算科学手法を組み合わせた、糖鎖の新しい物理化学解析法の開発に取り組みました。その結果、糖鎖の立体構造をダイナミックな揺らぎを含めて描き出すことが可能になりました。これにより、糖鎖が関わる生命現象メカニズムの一端についても解明が進みつつあります。本研究の進展により、病気原因の究明を含む、糖鎖の高次機能の更なる理解とその制御へ向けた道が開けるものと期待されます。

■受賞にあたっての一言
　タンパク質・核酸につぐ第3の生命の鎖と呼ばれる糖鎖には、様々な研究分野の垣根を超えて取り組むべき多くの課題や謎、そして面白さがあります。本当に幸いなことに、学生さんをはじめ共同研究者に恵まれ、合成化学や物理化学、分子生物学にわたる様々な方法を用いてここまで研究を展開することができました。あらためて感謝するとともに、化学と生物学の橋渡しとなるような糖鎖工学研究をさらに進めていきたいと考えています。

令和元年8月29日

　生命機能工学領域の藤本 健造教授、中村 重孝助教らの論文がWiley社刊行Chemistry an Asian Journal誌の表紙に採択されました。

■掲載誌
Chemistry an Asian Journal (IF=3.692) volume 14, Issue 11, 2019

■著者
Kenzo Fujimoto(教授)、Hung Yang-Chun(2017.3修了)、Shigetaka Nakamura(助教)

■論文タイトル
Strong Inhibitory Effects of Antisense Probes on Gene Expression through Ultrafast RNA Photocrosslinking

■論文概要
　今回藤本研究室のグループは、乳癌由来の培養細胞であるHeLa細胞を用い、モデル系である標的遺伝子の発現を、超高速光架橋型人工核酸(^CNVD)を組み込んだDNAプローブを用いることによりほぼ完全に抑制することに成功しました。光照射の場所やタイミングにより遺伝子発現を制御することができるため、疾患部位のみに薬効を発揮させることができます。また、光照射エネルギーにより遺伝子発現量を制御することができるため、細胞内遺伝子発現を最適な量に調節することが可能となりました。これにより従来は困難であった発現量の調節も可能となります。
　今後、遺伝子の異常発現を伴う細胞の癌化に対し、有用な治療法となると期待できます。また、超高速光架橋核酸(^CNVD)は日華化学株式会社より販売されており、本研究成果の普及に大きく寄与することが期待されます。

論文詳細：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/asia.201801917

平成31年6月11日

「光で細胞内遺伝子発現を制御することに成功」
－核酸医薬への応用に期待－

ポイント

• 超高速光架橋型人工核酸(^CNVD)を用いることで遺伝発現を制御可能
• 悪性遺伝子の発現抑制にも応用可能

	細胞内での様子を表したイメージ図、光照射により超高速光架橋型人工核酸を含むDNAがターゲットmRNAに光架橋する様子
図1.光照射による細胞内遺伝子発現の光制御しているイメージ図 光応答性人工核酸を組み込んだDNAプローブを細胞内に導入し、光照射により細胞内遺伝子発現を抑制することに成功している。特に照射エネルギーを調節(リモコン)することにより発現量を制御することができ、リモートでも遺伝子発現量の調節に成功した。

図2. 光架橋型人工核酸を組み込んだDNAプローブによる遺伝子発現の抑制
光架橋型人工核酸を組み込んだDNAプローブを細胞内に導入し、光照射を行うと、標的のメッセンジャーRNA(mRNA)と光架橋する。それにより翻訳を阻害するため、遺伝子発現を抑制することが可能となる。

図3. 超高速光架橋型人工核酸（CNVシリーズ）
超高速光架橋型人工核酸（CNVシリーズ）は数秒の光照射でDNAやRNA間をつなげることができる。世界最高速を誇るCNVシリーズは藤本研究室オリジナルな分子であり、日華化学株式会社より販売が開始されている。

＜今後の展開＞
　細胞の癌化の多くは遺伝子が傷つき、遺伝子の発現パターンが変化したことを原因とする。今回、光照射による発現量の制御は、遺伝子の過剰発現を伴う細胞の癌化に対し、その発現量を適切な範囲内に調節できる可能性を有しており、近年注目されている核酸医薬としての展開が期待される。

＜用語解説＞
*1 遺伝子の過剰発現
DNAにコードされた多くの情報はRNAへと転写された後、たんぱく質へ翻訳される。通常、この一連の流れは精密に制御されているが、何らかの原因でストッパーが外れたかのようにこのサイクルが回り続けることがある。これを遺伝子の過剰発現と呼び、細胞の癌化の一つの原因でもある。

*2 核酸医薬
医薬品の一つの種類であり、DNAやRNAなどを直接医薬品として用いる薬剤の総称。核酸類の高い配列認識能を利用し、標的とする分子のみに作用する分子標的薬の一種。これまで主流とされてきた抗体医薬とは異なり、副作用の低減が期待できる。近年、新たな医薬品として注目されており、すでに市販されているものもいくつかある。

*3 超高速光架橋型人工核酸
DNAやRNAなどの核酸同士を連結することができる人工核酸であり、有機化学的に合成される。特に、藤本研究室が報告しているCNVシリーズは数秒の光照射により反応する世界最高速の光架橋型人工核酸である。

*4 DNAプローブ
短鎖の合成DNAであり、今回の実験ではGFPのmRNAのアンチセンス核酸として機能する。配列を自由に設計することができるため悪性遺伝子に対し、設計することでその遺伝子発現を抑制することができる。

＜論文＞

令和元年6月1日